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원유검사-세균수 검사

   미생물에 의한 원유(raw milk)의 오염과 그 방지는 우유 및 유제품의 처리가 공과 그 품질관리면에서 매우 중요하며, 원유의 미생물 오염정도는 최종제품의 품질을 근본적으로 좌우하게 된다. 원유의 미생물 오염은 젖소의 유방내에 침입 된 미생물 또는 착유과정 및 집유과정에서의 오염이 주요한 것들이다. 원유내의 미생물은 주로 그람양성균과 그람음성균이며, 그외에도 효모(yeast), 곰팡이 (mold) 등이 존재할 수 있으며, 이들 균은 유제품에 나쁜 영향을 미치게 되므 로 위생적인 측면과 유제품의 품질보장을 위해서도 원유중 세균수를 엄격히 규제 해야 한다.
   따라서 원유의 세균수 검사는 우유의 생산과 저장과정중의 위생상태를 평가하 고, 살균후 생존하는 미생물이 유제품의 품질에 미칠 영향을 판단하기 위해서 반 드시 수행되어져야 한다. 세균수 검사법에는 세균 집락을 측정하는 방법과 세균 을 직접 계수하는 방법, 세균의 활성도를 측정하는 방법 등이 있다.

표준한천평판배양법(standard agar Plate count method)

  • 표준한천평판배양법에 의한 세균수 측정은 전세계적으로 가장 널리 이용되고 있으며, 일정한 배수로 희석된 우유를 배지에 접종하여 30℃에서 72시간 배양했 을때 집락형성단위(colony forming unit)를 계산함으로써 우유중의 생균수를 측정하는 방법으로서 그 순서는 다음과 같다.
    • 표준평판한천배지(Plate Count Agar) 23.5g을 삼각후라스크에 넣은 다음 증류수 1,000ml 를 가하여 잘 용해시켜 121℃에서 15분간 고압 멸균한 후 44∼46℃ 되게 조정한 항온수조에 보관한다.
    • 멸균된 6부 시험관에 멸균 생리식염수(0.85% NaCl) 또는 인산염완충 액을 10ml 피펫으로 9ml씩 균등하게 분주한다.
    • 검사시료 1ml를 취하여 (나)의 6부시험관에 접종하여 10배 계단희석법 으로 희석한다.
    • 희석된 시료는 5ml 피펫으로 각 희석배수당 샤레 3매에 1ml씩을 가한 다.
    • 각 샤레에 항온수조에 보관된 표준평판 한천배지 15ml씩을 분주하여 회 전시키면서 혼합한 다음 정지하여 굳히며 혼합시 배지가 뚜껑에 묻지 않 도록 특히 주의한다.
    • 표준평판한천배지가 완전히 굳은 후 (약 5∼10분 경과후) 5ml의 한천배 지로 중층하여 굳힌 다음에 30℃ 부란기에서 72시간동안 뒤집어서 배양 한다(개정 IDF법 ).
    • 집락계단은 확산 집락이 없고 집락수가 30∼300개의 집락을 형성한 샤 레 3매의 집락수를 계산하여 3개 평판의 평균치를 구하고, 여기에 해당 되는 희석도를 곱하여 시료 1ml중의 세균수를 계산한다.

세균을 직접 계수하는 방법

  • 직접현미경법(direct microscopic count method)
    • 직접 현미경을 통하여 원유중의 미생물 수를 세는 방법으로 Breed에 의해 개 발되었고(Breed법), 슬라이드의 1㎠ 내에 우유 0.Olml를 도말건조시켜 염색 후 직접 세균수를 세고, 현미경 계수를 곱하여 원유 1ml중의 세균수를 산정한 다.
  • Bactoscan technique
    • 원유중의 미생물을 형광염색 물질로 염색하여 형광현미경을 통해 연속적으로 세균을 세는 자동화된 미생물 계수장치이다. 40℃ 되게 처리한 원유를 lysing용 액으로 카제인과 체세포 등을 용해시켜 단백질 분해효소(proteolytic enzyme) 에 의해 분해시키고, 미생물은 acridine orange용액으로 염색 후 continuous flow epifluorescent 현미경에 의해 감지되어 박토스캔에 의해 계수된다. 이 기기는 시간당 80개 시료를 처리할 수 있고, 시료 1개의 검사시간은 약 15분이 소요된다(시료의 예열처리 10분 + Bactoscan 측정시간 5분).

세균의 활성도를 측정하는 방법

  • Impedance method
    • Impedance란 전도물질에 흐르는 교류전류에 대한 저항을 말한다. Impedance method는 이 원리를 기초로하여 배지에 접종된 미생물의 대사산 물들로 인한 전기적인 impedance의 변화량을 측정하는 방법이다. Conductance는 저항의 역치이다. 이 원리를 이용한 기기로는 박토미터(Bactometer)와 맬더스(Malthus)가 있다. 표준평판배양법의 결과를 이 기기의 감지시 간(Detection time)과 관계시켜 두 방법간의 상관관계가 0.95 이상되게 보정 (calibration)하여 사용한다.
  • ATP method
    • 모든 생윤에 존재하는 ATP를 추출하여 생물발광성(bioluminescence)에 ATP 가 소모되는 원리를 이용하여 미생물 수를 측정하는 방법이다. 전제 조건으로는 세 포내 ATP 함량이 모든 종류의 미생물에서 동일해야만 품질 평가 방법으로 사용될 수 있다.

세균수 검사장비의 표준화

   세균집락을 측정하는 방법인 표준평판배양법(standard agar plate count method)은 전세계적인 표준방법으초 가장 널리 이용되고 있지만 이 검사법은 검사시작후 72시간이 경과한 후에 결과를 알 수 있고 많은 노동력을 필요로 하 여 다량의 시료를 검사하는데는 한계가 있다.
   또한 세균을 직접 계수하는 방법인 직접현미경법은 15분 정도이면 검사결과를 얻을 수 있으므로 표준평판배양법에 비하면 횔씬 신속하지만 생균수와 사균수를 모두 계수한 결과를 얻고, 아주 작은 양의 시료를 취해야 하므로 실험 결과의 반 복성이 좋지 않기 때문에 원유의 미생물수를 측정하기 위한 일반적인 방법으로서 는 부적당하는 것으로 알려져 있다. 이와같은 원리를 이용한 박토스캔 (Bactoscan)은 원유중의 미생물을 형광염색 물질로 염색하여 형광현미경을 통 해 연속적으로 세균을 계수하는 자동화된 미생물 계수장치로서 이 검사법은 검사 시작후 신속하게 검사결과를 알 수 있으므로 선진국에서 다량의 시료를 검사하는 데 많이 사용 된다. 그러나 이 기기는 장비가 비싸고 생균과 사균을 동시에 측정 되므로 세균수 수준에 따라 표준평판배양법과의 상관관계를 고려하여 보정한 다 음 사용해야 한다.
   세균수를 검사하는 또 다른 방법으로는 세균의 활성도를 측정하는 Impedance method가 있으며, 이 원리를 이용한 기기로는 박토미터(Bactometer)와 맬더스(Malthus)가 있다. 이 방법도 표준평판배양법의 결과를 이 기기의 감지시간(Detection time)에 기록하여 두 방법간의 상관관계가 0.95 이상되게 보정(calibration)하여 사용한다. 이 검사법은 표준평판배양법과 유사 하여 배지에 시료를 접종하고 배양한 다음 2∼12시간후에 결과를 알 수 있으며 한번에 검사할 수 있는 시료수가 제한되어 있다. 그러나 이 방법은 시료중 미생 물을 종류별로 검사할 수 있어 유가공 공장에서 품질관리용 또는 원유의 세균분 포 파악 용도로 활용이 가능하여 세균수 검사에도 사용되고 있다. 이 기기도 박 토스캔처럼 표준검사법인 표준평판배양법과의 상관관계를 고려하여 보정곡선을 작성한 다음 사용해야 한다.
   국내에서도 1993년 6월 1일부터 세균수에 의한 유대 지불제도가 시행된 이후 이러한 자동화 기기가 많이 도입되었으며, 세균수 위생등급 실태에 맞는 표준곡 선을 작성하여 사용되고 있다.